生物制藥生產(chǎn)商對內(nèi)毒素有兩個(gè)擔(dān)憂。首先，注射成品中的內(nèi)毒素含量必須低于內(nèi)毒素限值。這一問題適用于所有注射藥物、生物制品和無熱原醫(yī)療器械。這方面的文獻(xiàn)記載很多，本文不再討論。第二個(gè)問題是內(nèi)毒素對用于生產(chǎn)生物制藥的表達(dá)系統(tǒng)和產(chǎn)品本身的影響。

內(nèi)毒素對不同細(xì)胞類型或細(xì)胞系的影響差別很大。我們應(yīng)該了解內(nèi)毒素對相關(guān)細(xì)胞的影響，以便采取適當(dāng)?shù)目刂拼胧?/span>。即使是母細(xì)胞系和子細(xì)胞系，對內(nèi)毒素的敏感性也可能大相徑庭。1對所用的細(xì)胞表面受體的認(rèn)識可以提醒研究者注意潛在的內(nèi)毒素敏感性。人體細(xì)胞上的CD14受體與內(nèi)毒素敏感性密切相關(guān)。2當(dāng)培養(yǎng)基中含有血清時(shí)，這一點(diǎn)尤為重要。血清成分，如脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）和septin復(fù)合物，可增強(qiáng)CD14細(xì)胞對內(nèi)毒素的激活作用。3,4相反，一些哺乳動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的細(xì)胞系統(tǒng)對內(nèi)毒素具有耐受性。細(xì)菌和酵母培養(yǎng)基中內(nèi)毒素的存在通常不是一個(gè)問題。下文將舉例說明內(nèi)毒素對生物系統(tǒng)的影響。

在涉及細(xì)胞培養(yǎng)的研究中，必須防止因生物對污染物的反應(yīng)而產(chǎn)生的虛假結(jié)果。此外，還必須將產(chǎn)物的特性與污染物內(nèi)毒素的特性區(qū)分開來，細(xì)胞因子尤其如此。

一、膜和形態(tài)學(xué)效應(yīng)

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的兩親性膜成分。它可能會干擾其他細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和功能，這并不奇怪。內(nèi)毒素通過磷酸基團(tuán)與陽離子蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，其脂肪酸鏈則與脂質(zhì)膜和蛋白質(zhì)的親水區(qū)發(fā)生作用。內(nèi)毒素與細(xì)胞膜的相互作用可能表現(xiàn)為明顯的形態(tài)學(xué)變化，如中國倉鼠卵巢細(xì)胞膜紊亂、5表面褶皺和細(xì)胞器增多、6細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大液泡、7形態(tài)學(xué)損傷和己糖攝取減少、8和嚴(yán)重的膜損傷。9有時(shí)形態(tài)變化暴露于清潔介質(zhì)后是可逆的。10此外，不同的內(nèi)毒素對形態(tài)學(xué)的影響也不同。11

情況嚴(yán)重的話，內(nèi)毒素對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的影響可能具有細(xì)胞毒性。不同內(nèi)毒素12和不同細(xì)胞系之間的毒性程度各不相同。13然而，至少有一些細(xì)胞可能誘導(dǎo)對內(nèi)毒素的耐受性。14

二、分泌/生產(chǎn)

細(xì)胞膜對細(xì)胞產(chǎn)物的合成至關(guān)重要，內(nèi)毒素會影響這一合成過程。這顯然是細(xì)胞研究和商業(yè)細(xì)胞系開發(fā)的關(guān)鍵問題。細(xì)胞的敏感性是多種多樣的；例如，從內(nèi)毒素反應(yīng)親本中克隆了兩種無反應(yīng)的T細(xì)胞系。15此外，內(nèi)毒素的反應(yīng)可能會受到其他因素的影響，如溫度。16

內(nèi)毒素對體外單細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響已被廣泛報(bào)道。內(nèi)毒素被認(rèn)為是腫瘤壞死因子（TNF）產(chǎn)生的有效刺激物。17已經(jīng)注意到對轉(zhuǎn)錄的影響，18,19,20,21并且已經(jīng)提出刺激的主要調(diào)節(jié)可能發(fā)生在這個(gè)水平上。22

除細(xì)胞因子外，一系列細(xì)胞產(chǎn)物也受到內(nèi)毒素的影響。哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成受到刺激或增強(qiáng)的產(chǎn)物包括前列腺素、23酸性磷酸酶、6纖維蛋白溶解抑制劑、24膠原酶生成、25神經(jīng)生長因子、26B因子分泌、27多肽、28血小板激活因子、29粘附抑制劑、30粘附分子-131和促凝劑（劑量依賴性）。

已觀察到內(nèi)毒素對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性33、蛋白多糖23和α2 巨球蛋白34的合成有抑制作用。這些反應(yīng)可能與劑量有關(guān)，在某些情況下，不同的內(nèi)毒素會產(chǎn)生不同的反應(yīng)。例如，在某些劑量下，乳桿菌內(nèi)毒素會刺激磷酸酶的產(chǎn)生，而大腸桿菌內(nèi)毒素則會抑制磷酸酶的產(chǎn)生。11

三、有絲分裂

內(nèi)毒素對某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型和品系具有強(qiáng)烈的有絲分裂作用。這種效應(yīng)會給易感細(xì)胞的培養(yǎng)帶來問題。另一方面，一些歷史悠久的細(xì)胞系對培養(yǎng)基中的高濃度內(nèi)毒素具有耐受性。有報(bào)道稱，有絲分裂性與幾種不同內(nèi)毒素的LAL反應(yīng)性和熱原性之間存在相關(guān)性。35然而，正相關(guān)性并不總是很明顯，同樣有絲分裂性的內(nèi)毒素在LAL反應(yīng)性和熱原性方面可能存在顯著差異。36因此，LAL活性不是內(nèi)毒素有絲分裂性的良好預(yù)測指標(biāo)。37

一些有絲分裂原受到內(nèi)毒素的嚴(yán)重污染（表1），其高濃度使人懷疑內(nèi)毒素對其有絲分裂作用的影響。有報(bào)道稱，內(nèi)毒素和有絲分裂的作用具有相似性。38

Concanavalin A（刀豆凝集素A ）

Pokeweed mitogen（美洲商陸有絲分裂原）

表1.兩種有絲分裂原種的內(nèi)毒素濃度39

更為復(fù)雜的是，內(nèi)毒素可以抑制細(xì)胞分裂，與刺激有絲分裂一樣，這些作用取決于內(nèi)毒素的來源。40可能存在濃度依賴性效應(yīng)，從促進(jìn)有絲分裂到抑制更高濃度的有絲分裂。值得注意的是，一些常用有絲分裂中的內(nèi)毒素濃度與某些細(xì)胞系中抑制細(xì)胞分裂的內(nèi)毒素濃度一樣高。

四、其他影響

文獻(xiàn)中報(bào)道的內(nèi)毒素對其他體外細(xì)胞的其他影響包括：影響粘附性、41胰島素結(jié)合和內(nèi)吞作用的減少、42TNF結(jié)合位點(diǎn)的喪失、43保護(hù)細(xì)胞免受HIV感染、44殺瘤活性45以及鉀電流和鉀通道數(shù)量的增加。46

五、多重效應(yīng)和協(xié)同作用

內(nèi)毒素引起的多種生物反應(yīng)可能造成因果關(guān)系的混亂。內(nèi)毒素對細(xì)胞產(chǎn)物分泌的影響可能是間接的。例如，干擾素抗體可阻止內(nèi)毒素對彈性蛋白酶分泌的明顯抑制作用。這表明細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素導(dǎo)致了抑制作用。在抗體存在的情況下，內(nèi)毒素實(shí)際上增加了彈性蛋白酶的分泌。因此，抑制作用是繼發(fā)性的，是由于內(nèi)毒素刺激了干擾素的產(chǎn)生。47

同樣，培養(yǎng)的心臟細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪酶產(chǎn)生80%的抑制作用是由細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF介導(dǎo)的。48這些觀察結(jié)果是一個(gè)明確的警告，觀察到的影響可能是內(nèi)毒素暴露的間接后果。類似地，有絲分裂性可能是次要效應(yīng)。內(nèi)毒素刺激巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-1已被證明在脾臟細(xì)胞中有致裂作用。49在這種情況下，這種作用是由牙齦擬桿菌的內(nèi)毒素引起的，而不是由腸道細(xì)菌引起的。淋巴因子和內(nèi)毒素之間有趣的協(xié)同作用可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，這種反應(yīng)已被建議作為細(xì)胞毒性試驗(yàn)的替代品。50

在另一項(xiàng)研究中，內(nèi)毒素與細(xì)胞因子在同一系統(tǒng)中既有協(xié)同作用，也有拮抗作用。51粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子使細(xì)胞對內(nèi)毒素產(chǎn)生反應(yīng)，從而誘導(dǎo)TNF的產(chǎn)生。TNF刺激lL-6的產(chǎn)生，從而在負(fù)反饋循環(huán)中抑制TNF的進(jìn)一步產(chǎn)生。

六、體外受精

體外受精是組織培養(yǎng)技術(shù)的一種特殊應(yīng)用。在低內(nèi)毒素濃度的培養(yǎng)基中可以提高受精率。52在培養(yǎng)基中檢測不到內(nèi)毒素的情況下（檢測限為0.1ng/ml），懷孕率為27.2%，而在含有內(nèi)毒素的情況下，懷孕率僅為6.3%。內(nèi)毒素存在時(shí)，形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。在另一項(xiàng)研究中，53在內(nèi)毒素濃度高于1ng/ml時(shí)，觀察到孕體中碎片的程度不斷增加。當(dāng)內(nèi)毒素濃度低于1ng/ml時(shí)，卵母細(xì)胞受精率為66%，而當(dāng)內(nèi)毒素濃度大于1ng/ml的時(shí)候，受精率為53%。比較妊娠情況時(shí)，差異更為明顯。當(dāng)培養(yǎng)基中內(nèi)毒素濃度超過1ng/ml時(shí)，妊娠率為8%，未檢測到內(nèi)毒素（0.1ng/ml）時(shí)，妊娠率為32%。

七、結(jié)論

由于細(xì)胞對內(nèi)毒素的反應(yīng)千差萬別，因此無法確定內(nèi)毒素開始干擾細(xì)胞功能和生長的臨界水平，也不可能說明這種干擾可能采取的形式。內(nèi)毒素的影響和所討論的細(xì)胞的敏感性只能通過在沒有可檢測到的內(nèi)毒素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來確定。這可能可行，也可能不可行。如果可行，可以確定臨界污染水平并設(shè)定限制。

人們早已認(rèn)識到內(nèi)毒素對細(xì)胞過程的影響。由于血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的廣泛使用54，人們對血清的內(nèi)毒素污染給予了特別關(guān)注。Fumarola和Jirillo55,56強(qiáng)烈呼吁人們認(rèn)識到內(nèi)毒素對細(xì)胞系的影響，以及適當(dāng)降低內(nèi)毒素濃度的必要性。他們指出，“生物學(xué)中常用的一些制劑受到內(nèi)毒素污染，可能會產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。"至少有一種說法認(rèn)為組織培養(yǎng)基中“絕對不存在"內(nèi)毒素。57這些作者還討論了使用內(nèi)毒素刺激細(xì)胞并提高其反應(yīng)性的問題，但顯然是以受控的方式。

應(yīng)盡量減少產(chǎn)品的內(nèi)毒素污染，而不僅僅是因?yàn)閾?dān)心熱原性和內(nèi)毒素限值。一些生物技術(shù)產(chǎn)品的特性是與內(nèi)毒素相同的。58如果制劑被內(nèi)毒素污染，就無法對這些產(chǎn)品進(jìn)行適當(dāng)評估。研究人員使用End-X B15內(nèi)毒素親和樹脂（美國ACC）的經(jīng)驗(yàn)很好地說明了這一點(diǎn)。從蛋白質(zhì)溶液中成功地去除了內(nèi)毒素，遠(yuǎn)低于令人擔(dān)憂的水平，該蛋白質(zhì)的特異酶活性不受處理的影響。然而，該制劑的有絲分裂活性卻急劇下降。研究人員最終得出結(jié)論，原始制劑的有絲分裂性可能是由于大量內(nèi)毒素污染造成的，而不是蛋白質(zhì)的固有特性。

內(nèi)毒素污染的問題應(yīng)該在產(chǎn)品開發(fā)的早期解決，當(dāng)然也應(yīng)該在擴(kuò)大規(guī)模之前解決。這樣既能最大限度地減少有害影響，又能正確確定產(chǎn)品的特性，對內(nèi)毒素相關(guān)問題的及早關(guān)注可能會持續(xù)到全面生產(chǎn)。當(dāng)內(nèi)毒素規(guī)范對生物制藥和傳統(tǒng)生產(chǎn)的治療方法同樣重要時(shí)，這將有利于最終釋放測試。

參考文獻(xiàn)