一、介紹

干熱法是制藥行業(yè)公-認(rèn)的去熱原方法。本文介紹了一系列研究，以確定除干熱法外，是否還能用其他方法成功去除熱原。去熱原是指去除或滅活熱原。在實(shí)踐中，通過證明去熱原工藝能夠?qū)⒓?xì)菌內(nèi)毒素降低到可接受的水平來對其進(jìn)行鑒定。與滅菌一樣，去熱原是一個(gè)絕對的術(shù)語，由于測試不敏感，只能在理論上進(jìn)行證明[1]。

玻璃器皿的去熱原在腸胃外藥物的生產(chǎn)中非常重要，因?yàn)闅埩舻臒嵩罱K可能被注射到患者體內(nèi)，導(dǎo)致不良反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)室中，用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的玻璃器皿必須進(jìn)行去熱原處理，以最-大-程-度地減少檢測污染；采樣容器也必須不含熱原，以避免樣品污染和檢測到假陽性結(jié)果[2]。對注射用藥物生產(chǎn)中使用的玻璃器皿構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)的主要熱原物質(zhì)是內(nèi)毒素。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌外壁中含有的天然熱穩(wěn)定脂多糖[3]。它在細(xì)菌細(xì)胞死亡、裂解、生長和增殖過程中釋放到環(huán)境中 [4, 5]。由于其普遍性和效力，內(nèi)毒素被認(rèn)為是最重要的熱原[6]。

與藥物相關(guān)的內(nèi)毒素的一個(gè)問題是它們具有熱穩(wěn)定性，使其能夠抵抗大多數(shù)傳統(tǒng)的滅菌過程，因此需要對活細(xì)胞和內(nèi)毒素進(jìn)行單獨(dú)的測試。。制藥工藝和設(shè)備面臨內(nèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)。因此，去熱原是在藥品制備過程中保持無菌保證的重要因素。有幾種不同的方法來實(shí)現(xiàn)去熱原（包括超濾、離子交換色譜和使用酸堿水解）。可以說，最常見的去熱原設(shè)備是那些使用干熱操作的設(shè)備（例如使用單向熱空氣的去熱原通道，用于準(zhǔn)備初級(jí)包裝物品（產(chǎn)品小瓶）以進(jìn)行無菌灌裝[7]。

監(jiān)管機(jī)構(gòu)對去熱原的要求各不相同。歐洲藥典規(guī)定用于熱原測試的玻璃在 250°C 下干熱 30 分鐘，或在 200°C 下干熱 60 分鐘以進(jìn)行去熱原，但對于用于注射用的玻璃器皿的去熱原沒有書面要求 [8]。用于鱟試劑測試的玻璃器皿必須進(jìn)行去熱原處理，使其水平低于測試的靈敏度。USP<1211>和 FDA 指南不包含溫度規(guī)范，但要求內(nèi)毒素從至少 1000個(gè)內(nèi)毒素單位（EU）的起始濃度減少3對數(shù)（log），以進(jìn)行去熱原[9]。

就去熱原反應(yīng)而言，干熱滅活時(shí)，內(nèi)毒素遵循線性對數(shù)減少曲線，直至減少至3對數(shù)。這種破壞持續(xù)發(fā)生但不一定遵循線性回歸后，而是“雙相"減少[10]。

內(nèi)毒素指示劑

使用內(nèi)毒素指示劑評估內(nèi)毒素的減少情況，所述內(nèi)毒素指示劑使用源自大腸桿菌o113:H10的對照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）制劑制備的。使用的CSE應(yīng)類似于使用鱟試劑（LAL）方法進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)（BET）所用的內(nèi)毒素，并可追溯到參考標(biāo)準(zhǔn)。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)

行業(yè)內(nèi)對如何制備內(nèi)毒素指示劑存在一些爭議；制備內(nèi)毒素指示劑的方法有兩種，一種是將內(nèi)毒素添加到要去熱原的物品表面并將其烘干，另一種是使用預(yù)先制備好的內(nèi)毒素指示劑來實(shí)現(xiàn)的。 在這兩種方法中，筆者更傾向于第一種方法。因?yàn)閮?nèi)毒素直接用于去熱原的設(shè)備表面[11]，這種方法被認(rèn)為更具挑戰(zhàn)性。

二、研究設(shè)計(jì)

這項(xiàng)研究的目的是確定除干熱法外，是否還能用其他方法成功去除熱原。研究了兩種替代方法：濕熱（高壓滅菌）和苛性堿沖洗，并將結(jié)果與干熱去熱原進(jìn)行了比較。[12]

三、驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)

目前還沒有針對玻璃最終產(chǎn)品容器的藥典內(nèi)毒素耐受限值 (K)，因此本研究采用了醫(yī)療器械的限值，即0.5EU/ml。

四、方法學(xué)

本研究選擇的方法為動(dòng)態(tài)濁度法LAL（鱟試劑）試驗(yàn)（根據(jù)《歐洲藥典》<2.6.14>中的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)）。LAL試驗(yàn)基于從鱟中分離出來的裂解酶，這種酶在內(nèi)毒素存在的情況下會(huì)凝結(jié)成塊[3]。在實(shí)踐中，對于動(dòng)態(tài)濁度法試驗(yàn)，LAL反應(yīng)速率是用達(dá)到預(yù)定的“閾值"光密度所需的時(shí)間來表示的，稱為起始時(shí)間[13]。內(nèi)毒素濃度越高，起始時(shí)間越短。內(nèi)毒素濃度是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)）計(jì)算得出的，該曲線是通過對數(shù)起始時(shí)間與對數(shù)內(nèi)毒素濃度的線性回歸計(jì)算得出的[14]。樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和對照品至少進(jìn)行一式兩份的測試。陽性產(chǎn)品對照回收率應(yīng)在50-200%的范圍內(nèi)。

這項(xiàng)研究使用了用注射用水沖洗過的玻璃瓶，制備了50000 EU/ml的內(nèi)毒素溶液。用0.1ml溶液接種到小瓶中，得到理論上5000EU的加標(biāo)值，并在單向氣流柜中風(fēng)干過夜。之所以選擇0.1 ml的接種量，是因?yàn)橛形墨I(xiàn)報(bào)道，較小的接種量可減少吸附，從而使小瓶中的內(nèi)毒素回收率更高且更穩(wěn)定。制備完成后，將內(nèi)毒素指示劑與兩個(gè)陽性對照一起放置在去熱原裝置中的指-定位置（10 個(gè)內(nèi)毒素指示劑被認(rèn)為足以評估去熱原能力）。

五、處理和測試

共進(jìn)行了三種處理：

1、干熱：將小瓶在250°C的Carbolite烘箱中處理30分鐘?！睹绹幍洹窡嵩瓬y試章節(jié)<151>中規(guī)定，在250°C下加熱不少于30分鐘以去除玻璃器皿和器具的熱原。

2、濕熱：將小瓶在121°C下高壓滅菌30分鐘；該高壓滅菌周期是用于對設(shè)備進(jìn)行消毒的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)。

3、苛性堿：每個(gè)小瓶用10ml的0.1 mol/L氫氧化鈉沖洗1分鐘。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這種濃度的苛性堿能夠去熱原[17]。進(jìn)行 1 分鐘的清洗是因?yàn)樗强尚械模⑶胰绻@示成功的話可以很容易地實(shí)施和進(jìn)行。

除干熱外，每種處理均進(jìn)行三次運(yùn)行，因?yàn)榻Y(jié)果表明，前兩次運(yùn)行后去熱原 100% 成功（正如已建立的成熟技術(shù)所預(yù)期的那樣）。

處理后，每個(gè)小瓶加入5ml緩沖液，并在超聲波浴中超聲處理15分鐘，然后放置在軌道振蕩器上直至測試。在測試之前，將所有瓶子渦旋混合一分鐘。文獻(xiàn)中建議將超聲波處理和渦流相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)最佳的內(nèi)毒素回收率。

所有樣品均根據(jù) 5.0 EU/ml 至 0.005 EU/ml 范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行重復(fù)檢測。陽性對照、濕熱處理后樣品和苛性堿處理后樣品需要稀釋，以使可檢測的內(nèi)毒素處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。每次檢測至少有一個(gè)處理過的樣品和所有對照組都加了 0.5 EU/ml 的內(nèi)毒素。檢測樣品時(shí)，在裂解反應(yīng)管中用 LAL 試劑水進(jìn)行 1:2 稀釋（對于需要稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的樣品和對照組，在檢測過程中還需進(jìn)行 1:2 的稀釋）。對于陽性產(chǎn)品對照，用1.0 EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1:2稀釋，得到與測試樣品相同的稀釋度，但內(nèi)毒素加標(biāo)量為0.5 EU/ml。陽性產(chǎn)品對照加標(biāo)回收率在50-200%之間表明沒有干擾，稀釋液適合測試。

六、結(jié)果

（一）數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel™和Systat 11™進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用雙向方差分析來檢驗(yàn)三種處理之間是否存在顯著差異。使用學(xué)生t檢驗(yàn)證實(shí)了差異。由于所測得的處理后內(nèi)毒素濃度取決于每次運(yùn)行的初始峰值，因此統(tǒng)計(jì)分析是根據(jù)內(nèi)毒素減少對數(shù)而不是所測得的實(shí)際內(nèi)毒素進(jìn)行的。這種方法降低了檢測到虛假意義的風(fēng)險(xiǎn)，并且不假設(shè)數(shù)據(jù)來自同一人群。

統(tǒng)計(jì)分析表明，干熱是去熱原最-有-效的處理方法，比濕熱和堿處理更能顯著降低內(nèi)毒素。雖然干熱處理是最-有-效的方法，但濕熱處理和苛性堿處理后內(nèi)毒素的平均對數(shù)下降值都是1.7，因此這兩種去熱原方法之間沒有顯著差異。

（二）討論

這項(xiàng)研究檢驗(yàn)了三種不同處理方法對玻璃器皿的去熱原效果。結(jié)果表明，干熱處理能穩(wěn)定地去除所有加標(biāo)瓶中的熱原，使內(nèi)毒素減少 3 個(gè)以上的對數(shù)下降值。這是意料之中的，因?yàn)楦蔁崾且环N普遍接受的去熱原方法。

盡管對干熱破壞內(nèi)毒素的機(jī)制尚未得到明確研究，但這可能是由于高溫導(dǎo)致分子不加選擇地焚燒造成的。 Ludwig和Avis [15] 認(rèn)為這是一種以自由基為介質(zhì)的氧化反應(yīng)，由生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的痕量金屬催化。這項(xiàng)研究表明，采用濕熱法，傳統(tǒng)的高壓滅菌循環(huán)在降低內(nèi)毒素濃度方面的效果遠(yuǎn)不如干熱法。所有經(jīng)過濕熱處理的瓶子都沒有達(dá)到 3-log的去熱原目標(biāo)，而且所有測試瓶子的處理后內(nèi)毒素含量都超過了4 EU/ml。內(nèi)毒素的熱穩(wěn)定性是眾-所-周-知的，傳統(tǒng)的高壓滅菌濕熱處理無法有效去除熱原。有報(bào)道稱，在過氧化氫存在的情況下，通過高壓滅菌可成功去除熱原，這種情況下的破壞被認(rèn)為是由于脂多糖脂質(zhì)A部分的脂肪酸被氧化所致[16]。 此外，長時(shí)間的高壓滅菌也被證明可以成功地去除熱原。這些都是未來研究中可以探索的途徑，但這兩種方法對于一般實(shí)驗(yàn)室來說都不可行。

用氫氧化鈉處理加標(biāo)瓶對內(nèi)毒素有負(fù)面影響，然而，3-log去熱原目標(biāo)無法始終如一地實(shí)現(xiàn)。雖然許多瓶子中的內(nèi)毒素降至低于可接受限值的水平，但這種情況并不一致。應(yīng)當(dāng)注意，苛性堿的清洗是手工進(jìn)行的；因此，去熱原過程中的不一致性可能與可能與混合過程的變化有關(guān)。

苛性堿處理過程中的破壞機(jī)制是由于內(nèi)毒素脂質(zhì)A部分中發(fā)現(xiàn)的酯和酰胺鍵的水解。酯鍵的堿性水解產(chǎn)生醇和酸式鹽稱為皂化，加熱可增強(qiáng)皂化效果[17]。因此，通過在苛性堿處理中加入加熱階段，可能會(huì)更有效地減少內(nèi)毒素。

七、結(jié)論

干熱被認(rèn)為是-最有-效的去熱原方法，其效果明顯優(yōu)于濕熱和苛性堿處理法。因此，這項(xiàng)研究支持大多數(shù)文獻(xiàn)中的普遍結(jié)論。

干熱持續(xù)實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素減少超過 3個(gè)對數(shù)級(jí)。本研究中的濕熱和堿處理方案不能一致地去熱原。與干熱相比，這兩種替代方法都沒有達(dá)到相同的可量化的內(nèi)毒素破壞水平。

本研究中使用的玻璃瓶在處理前已用注射用水沖洗過。購買的玻璃瓶通常含有雜質(zhì)，需要沖洗?；厥盏牟Ａ髅罂赡苡谢瘜W(xué)和生物沉淀物，可能會(huì)扭曲或掩蓋殘留的內(nèi)毒素。

這些雜質(zhì)和殘留物可能會(huì)影響玻璃的去熱原處理，應(yīng)在處理前將其去除；因此，有必要制定玻璃器皿去熱原處理的準(zhǔn)備程序。采取措施減少內(nèi)毒素是微生物控制的一個(gè)重要部分，這涉及到藥品加工以及需要制備材料或測試成分的實(shí)驗(yàn)室。這與內(nèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。內(nèi)毒素注射后的病理效應(yīng)是核心體溫迅速升高，隨后出現(xiàn)極快和嚴(yán)重的休克，往往在診斷出病因之前就已經(jīng)死亡[18]。

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